EL WESTERN BLOT

El Western Blot es una técnica que permite detectar proteínas de una manera muy específica. Estas proteínas a detectar provienen de un tejido de un animal que ha sido sometido a un protocolo de aislamiento de proteínas. Las proteínas son cargadas en un gel de poliacrilamida y se las somete a una electroforesis que separará nuestras proteínas en función de su tamaño y de su carga. Se debe utlizar un marcador de peso molecular para ver cual es la banda de nuestra proteína de interés. Después de la electroforesis se equilibran las membranas de nitrocelulosa o de PVDF. Se extraen los geles de la cubeta de electroforesis y se prepara la transferencia de las proteínas del gel hacia la membrana. Este procedimiento se realiza tambien en la cubeta llena de solución de transferencia. Se realiza la transferencia aplicando un campo eléctrico perpendicular al gel. Se realiza a 75 V y 400 mA durante 2 horas. A continuación una vez transferidas las proteínas del gel a la membrana, pueden ser estudiadas utilizando anticuerpos. Se incuba primero con el primario, se realizan lavados para quitar el exceso de anticuerpo, luego se incuba con un secundario y luego se realiza el revelado. Una vez que hemos revelado las membranas estas pueden ser escaneadas y se pueden introducir a un ordenador donde pueden ser estudiadas las bandas con algún programa de ordenador especialmente dedicado a ello.